多组学（单细胞、空间转录+蛋白、外显子、甲基化）揭示神经母细胞瘤异质性图谱

作者，Evil Genius

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今天继续我们的多组学，参考文章A spatial cell atlas of neuroblastoma reveals developmental, epigenetic and spatial axis of tumor heterogeneity,估计又是一篇CNS的文章。

神经母细胞瘤是一种儿童癌症，起源于发展中的交感神经肾上腺系，具有复杂的肿瘤间和肿瘤内异质性。除了发育上的差异，非恶性肿瘤微环境(TME)的组成在肿瘤内部和肿瘤间也存在变异性。肿瘤中恶性和非恶性细胞之间的信号传导可以影响治疗反应，包括对化学免疫治疗的反应。

取样：

涵盖了51名儿科患者的55个肿瘤，并涵盖了神经母细胞瘤的全部临床样本，符合sc/snRNA-seq和空间分析的标准。其中包括MYCN扩增(n=12)和ALK gain-of-function突变的神经母细胞瘤样本（n=9），27例样本(主要是3期或4期)在化疗治疗期间获得，其中9例接受了抗gd2抗体的化疗免疫治疗。

测序策略

1、scRNA-seq分析了13例新鲜肿瘤标本 2、43例冷冻标本进行snrna测序 3、肿瘤和种 germline DNA全外显子组测序(WES)(n=43) 4、 bulk RNA-seq (n=44), and DNA methylation (Illumina 850k BeadChip arrays; n=34) 5、空间转录组学方法Slide-seqV2和空间蛋白质组学方法CO-Detection（CONDX） 6、28例肿瘤采用多路免疫荧光进一步分析，11例肿瘤采用多路离子束成像(MIBI)分析。

Analysis of malignant cell-specific programs of neuroblastoma

神经母细胞瘤有三种主要的恶性细胞状态

snRNA和scRNA的区别

1、snRNA-seq谱的表达基因数量明显少于scRNA-seq 2、snRNA的线粒体读数比例较低 3、snRNA免疫细胞捕获比例高

初步的定义

免疫细胞群（CD45 (PTPRC)） 内皮细胞群（CD31 (PECAM1)） 交感肾上腺谱系（NCAM (NCAM1)） 交感病理肾上腺群进一步分为3组:第一组表达代表交感神经元分化不同阶段的基因(NRG3、NTRK3、DBH、ERBB4、CHGB)，与N型神经母细胞瘤细胞系中肾上腺素能(ADRN)基因的表达特征一致;第二组表达来自交感肾上腺系的间充质细胞中发现的基因群(FN1、ACTA2、COL1A1、EGFR)，与S型神经母细胞瘤细胞系中发现的间充质(MES)基因表达特征一致;一个类似增殖性交感神经母细胞的群(MKI67, TOP2A),在交感神经元和间充质细胞之间的连接处有哪些细胞符合它们产生两种细胞系的发育能力。

CNV分析识别恶性肿瘤细胞

肿瘤组成变化与MYCN扩增或治疗相关，比较有或没有MYCN扩增或治疗的细胞(恶性、免疫、内皮和其他非恶性)的比例。MYCN扩增的神经母细胞瘤中免疫细胞的比例降低(FDR<0.05)，与先前的报道一致。相反，化疗或化疗免疫治疗的中高危肿瘤，恶性细胞比例降低，免疫细胞比例增加。

单细胞数据识别肿瘤恶性细胞的异质性

数据表明，神经母细胞瘤肿瘤具有增殖的SYMP、分化的ADRN和MES细胞的混合物，其亚群跨越其发育层次的不同步骤。

Analysis of malignant cell-specific programs of neuroblastoma

Gene expression associated with malignant cell states and relationship to the fetal adrenal medulla

神经母细胞瘤恶性细胞组成的差异与预后相关

接下来，测试了恶性细胞亚群组成的变化是否与临床特征有关。分析发现，在MYCN扩增的肿瘤、婴儿病例(< 18个月)和未经治疗的病例中，SYMP细胞比例有统计学意义的增加。相反，虽然一些(15/55)肿瘤中MES神经母细胞瘤肿瘤细胞很少(<1%)，但MES细胞比例的差异(连续或离散)与MYCN扩增、风险组、年龄或治疗状态没有显著相关性(FDR>0.05, scCODA)。

由于神经母细胞瘤内不同的细胞状态预计具有不同的表观遗传谱，研究推断肿瘤的甲基化谱可用于准确地对具有不同细胞组成的肿瘤进行分组。事实上，儿童癌症的甲基化分组已经成功地确定了脑肿瘤和肉瘤的表观遗传亚群。聚类将肿瘤分为四个甲基化组，每个甲基化组与临床和分子因素的不同组合有关。

目前，神经母细胞瘤的风险分层包括多种临床、诊断和组织学特征，以识别死亡风险较高的患者。分析四组肿瘤患者的预后，发现I组或III组肿瘤患者的预后明显优于II组或IV组肿瘤患者。IV组患者的不良结果与该组中MYCN扩增肿瘤的富集一致。同样，III组患者的良好结果与4S期患者和年龄在18个月以下的婴儿的富集一致。综上所述，数据表明，神经母细胞瘤的细胞组成、DNA甲基化分组和预后之间可能存在相关性。

DNA methylation profiling identifies 4 subtypes of neuroblastoma that differ in malignant cell state composition and outcome

免疫浸润与神经母细胞瘤的临床特征相关(免疫细胞图谱)

Immune cell heterogeneity and spatial compartmentalization of neuroblastoma

为了更好地表征神经母细胞瘤组中不同的恶性和免疫细胞特征，使用多重离子束成像(MIBI)，结合金属偶联抗体和time-of-flight质谱，在福尔马林固定石蜡包埋组织中生成41种蛋白质的高分辨率空间图。首先对两个高质量肿瘤标本(HTAPP-102-SMP-11 (II组)和HTAPP-130SMP-91 (IV组))的MIBI捕获进行平片处理，生成大的2000 μm x 2000 μm阵列。CD56/NCAM(神经母细胞瘤标志物)、增殖(Ki67)和转录活性染色质(H3K27ac)的表达都在肿瘤邻近区富集，而免疫效应物标志物(CD11c、CD4和CD8)在基质邻近区富集。接下来，使用11例患者样本的30个样本(fov)进行了MIBI分析，主要来自II组(n=7)。根据蛋白表达来标注细胞类型，并观察了与sc/snRNA-seq相关的免疫细胞密度的样本间和区域间差异。邻域分析(n=30)确定了细胞类型共定位的广泛模式。与PLANB一致，恶性肿瘤细胞分裂成一个免疫细胞很少的邻域，而免疫细胞丰富的邻域有四种不同的原型。例如，邻域“3”特别富含B细胞，而巨噬细胞主要定位于邻域“2”，也含有CD4 T、CD8 T和树突状细胞(DC)。

Multiplexed ion-beam imaging (MIBI) identifies compartmentalization of tumor and immune cells

由于MIBI提供了神经母细胞瘤空间组织的高分辨率地图，但无法在样本的大面积范围内进行大规模操作，因此分析生成了包含52种抗体的10个HTAPP样本(具有匹配的MIBI数据)的CODEX数据，随后进行了成像分割、细胞标记聚类和细胞注释。利用扩大的CODEX规模来表征每个样本的整个肿瘤切片的肿瘤间和肿瘤内细胞异质性。首先，通过表达vimentin (VIM)、collagen IV (COL4)和podoplanin (PDPN)对CD56+ CD45−细胞进行了分区。

CD56+ VIM+ COL4+ PDPN+细胞呈薄而细长的形态，与神经细胞相邻，与Schwannian stroma 一致。CD56+ VIM - COL4 - PDPN -细胞具有神经母细胞瘤肿瘤细胞的组织学特征(蓝色小圆细胞)，增殖标志物Ki67阳性。CD56+ VIM+ COL4+ PDPN -和CD56+ VIM+ COL4 - PDPN -细胞少见且分布于整个肿瘤。分析不能从这些数据中判断这些细胞是否是恶性的。总的来说，由于可用的抗体，CODEX在免疫空间分析方面比神经母细胞瘤恶性细胞类型(ADRN, MES, SYMP)更有用。

根据细胞类型注释，确定了具有特征共定位细胞类型的细胞邻域(CNs)。恶性CD56+细胞主要在CN0中发现，不含其他细胞类型，与MIBI和多重免疫荧光分析一致。另外三个邻域(CN8、CN11和CN12)主要富集于免疫细胞类型，尤其是DC和T细胞。最后，7个邻域主要由基质细胞组成，包括2个富含淋巴细胞的邻域(CN1和CN7)和5个富含VIM+、COL4+基质的细胞邻域。

对10个样本中每个样本的整个肿瘤切片的细胞-细胞相互作用基质的无监督分析证实了神经母细胞瘤中免疫/基质成分的肿瘤细胞区域化。具体来说，CD56+肿瘤细胞自我结合成一个缺乏免疫细胞的生态位。每个肿瘤细胞周围依次被基质细胞、树突状细胞和T细胞组成的第二个生态位包围。第三种由CD56+ VIM+细胞组成，可能代表肿瘤细胞，正常细胞，或两者兼而有之.

综合来看，CODEX和MIBI显示了高度区域化的肿瘤组织。

Co-detection by indexing (CODEX) imaging of whole slides identifies recurrent patterns of cellular interaction

High-resolution spatial transcriptomics shows context-dependent shifts in expression

由于空间蛋白质组学中使用的抗体的数量和类型限制了我们恶性细胞的能力，最终通过SlideSeqV2分析了队列中10个肿瘤的19个冷冻切片，以10 μm分辨率生成空间转录组数据。然后，将我们的Slide-SeqV2和snRNA-seq图谱整合到空间分配细胞类型分布(细胞类型分解(RCTD))，克服了空间较低的分辨率，并在空间投射完整的基因表达图谱(使用TANGRAM)，克服了Slide-SeqV2中的数据稀疏性.

分析成功地分配了sc/snRNA-seq中定义的8种细胞类型，包括所有三种主要的恶性细胞亚群(ADRN, MES, SYMP)，三种广泛的免疫细胞类别(T细胞，B细胞，骨髓细胞)以及基质和血管内皮细胞。恶性细胞群比例在snRNA-seq和Slide-SeqV2之间存在相关性。然后，使用Slide-SeqV2数据中相对丰富的细胞特征来鉴定细胞-细胞共定位，发现ADRN和SYMP肿瘤细胞不太可能靠近髓细胞或T细胞，这与空间蛋白质组学分析(MIBI和CODEX)中观察到的区域化一致。相比之下，MES肿瘤细胞与TME中的免疫细胞有微弱但可检测的关联，这与II组肿瘤中MES细胞炎症program的高表达是一致的。

为了进一步研究，将数据进行聚类分析，然后将这些cluster聚集成富含肿瘤(>50%恶性细胞)和富含基质(<50%恶性细胞)的beads，然后比较每种细胞类型，在富含肿瘤和富含基质的细胞类型珠粒之间的差异表达(每切片)。最后，在19个样本中对每个区域中重复富集的基因进行了评分。基质限制性髓细胞一致表达单核细胞和DC标记物，包括MHC II类基因(HLA-DPB1、HLA-DRA、HLA-DRB1、CD74)和溶菌酶(LYZ)，而瘤内髓细胞表达更高水平的线粒体(如MT-CO1和MT-CO2)和抗氧化(如ATOX1、GSTP1、COX6C和OAZ1)基因，这提高了渗透到富含肿瘤区域的髓细胞经历代谢应激的可能性。事实上，CD68+巨噬细胞的snRNA-seq谱富集了FTL和TMSB10，两者都与Slide-SeqV2中的肿瘤内表达相关。

High resolution spatial transcriptomics with Slide-SeqV2 demonstrates myeloid reprogramming within neuroblastoma

数据分析需要注意的地方

单细胞

1、Gene and cell quality control consisted of three steps: (i.) removal of noise due to ambient RNA(CellBender), (ii.) removal of cell doublets(Scrublet), and (iii.) removal of cells with low library complexity or number of genes detected. 2、removed low-quality cells and nuclei with a low number of UMIs or genes detected. Depending on the data modality (single cell or single nucleus) and the 10x chemistry (V2 or V3), we used different thresholds. For single nucleus data collected using V2 chemistry, we kept nuclei with at least 400 UMIs and 200 genes detected. For all other data, we kept cells or nuclei with at least 1000 UMIs and 500 genes detected. 3、线粒体比例20%

外显子就是我之前分享的分析流程

空间邻域分析也是之前分享的重点

生活很好，有你更好